ISO 10993-26体外致敏性测试：KeratinoSens和SENsiPac方法对比

一、产业背景与范式转移的驱动力

1.1 从动物实验到体外方法的必然演进

医疗器械的生物相容性评价始终是产品注册上市的核心关卡。在ISO 10993体系下，致敏性测试（Sensitization）作为生物学评价的关键组成部分，长期依赖豚鼠最大值试验（ISO 10993-10）或局部封闭涂皮试验。然而，随着3R原则（替代、减少、优化）在全球监管体系中的深化，以及欧盟REACH法规、美国FDA现代化法案2.0的推动，体外替代方法正从辅助工具走向主流。2021年发布的ISO 10993-26《医疗器械生物学评价——第26部分：体外致敏性测试》正是这一趋势的集中体现。该标准正式将KeratinoSens和SENsiPac两种基于角质形成细胞和树突状细胞机制的体外方法纳入医疗器械致敏性评价的合规路径。

这一范式转移并非孤立事件。根据美国FDA在2023年发布的《医疗器械生物相容性评价指南》更新草案，明确鼓励采用经验证的体外替代方法，并指出在适当条件下，体外数据可替代传统动物试验用于上市前通知（510(k)）和上市前批准（PMA）申请。欧盟医疗器械法规（MDR）2017/745同样在附录A中强调，应优先使用非动物方法进行生物学评价。

1.2 产业痛点与市场驱动因素

医疗器械行业面临的现实压力包括：

据Grand View Research 2023年报告，全球医疗器械生物相容性测试市场规模在2022年已达18.3亿美元，预计2023-2030年复合年增长率为11.2%，其中体外替代方法细分市场增速达到15.8%，显著高于整体市场。

二、ISO 10993-26标准框架与核心要求

2.1 标准的定位与适用范围

ISO 10993-26《医疗器械生物学评价——第26部分：体外致敏性测试》正式发布于2021年，是ISO 10993系列中首个专门针对体外致敏性测试的标准。该标准规定了两种经验证的体外方法——KeratinoSens和SENsiPac——用于评估医疗器械材料及其可沥滤物的致敏性潜力。

标准适用范围包括：

  1. 医疗器械成品材料
  2. 原材料和添加剂
  3. 加工助剂和残留物
  4. 可沥滤物和降解产物

    5. 从实践来看，ISO 10993-26并非完全取代ISO 10993-10中的动物试验，而是提供了在特定条件下可接受的替代方案。标准明确指出，当体外方法结果为阴性时，可视为材料无致敏性风险；当结果为阳性时，需结合风险分析或其他数据综合判断，必要时仍需进行动物试验确认。

    2.2 标准的技术要求与验证准则

    ISO 10993-26对两种方法均设定了严格的技术验证要求：

    验证参数KeratinoSens方法要求SENsiPac方法要求
    细胞系HaCaT角质形成细胞系THP-1单核细胞系
    检测终点Nrf2/ARE通路激活（荧光素酶报告基因）CD86和CD54表达上调（流式细胞术）
    阳性对照2,4-二硝基氯苯（DNCB）2,4-二硝基氯苯（DNCB）
    阴性对照二甲基亚砜（DMSO）二甲基亚砜（DMSO）
    重复次数至少3次独立实验至少3次独立实验
    判断标准荧光素酶活性诱导倍数≥1.5倍CD86阳性细胞比例≥1.5倍或CD54阳性细胞比例≥2.0倍

    数据来源：ISO 10993-26:2021标准文本

    标准还规定了方法转移和验证的详细流程，包括：

    1. 实验室间比对验证
    2. 细胞系稳定性监控
    3. 阳性/阴性对照的周期性检测
    4. 测试样品制备的标准化要求（如浸提比例、浸提介质、浸提条件）

      5. 三、KeratinoSens方法：原理、流程与产业应用

      3.1 方法学原理与作用机制

      KeratinoSens方法由瑞士Givaudan公司开发，并于2018年通过OECD测试指南第442D项验证。该方法基于人角质形成细胞系HaCaT的基因修饰株，该细胞株稳定转染了含有荧光素酶报告基因的质粒，报告基因的表达受抗氧化反应元件（ARE）驱动。

      其作用机制为：当皮肤致敏物与角质形成细胞接触时，会激活Nrf2转录因子，Nrf2与ARE结合后启动下游基因转录，包括荧光素酶的表达。通过检测荧光素酶活性，可定量评估致敏物的致敏潜力。

      3.2 标准操作流程与关键控制点

      KeratinoSens方法的标准操作流程包括以下步骤：

      1. 细胞培养与准备：
      2. HaCaT-KeratinoSens细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养
      3. 细胞传代不超过20代，以保证报告基因稳定性
      4. 实验前24小时将细胞接种于96孔板，密度为1×10⁴细胞/孔
      5. 样品制备与暴露：
      6. 测试样品按ISO 10993-12要求制备浸提液
      7. 浸提介质包括细胞培养基（无血清）和DMSO（最终浓度≤1%）
      8. 浸提条件：37℃±1℃，24小时±2小时
      9. 浸提液需经过滤除菌（0.22μm滤膜）
      10. 细胞暴露与检测：
      11. 将浸提液按梯度稀释（通常为6个浓度）加入细胞培养板
      12. 暴露时间：48小时
      13. 同时设置阳性对照（DNCB，浓度梯度）和阴性对照（DMSO）
      14. 暴露结束后，裂解细胞并加入荧光素酶底物
      15. 使用酶标仪检测发光信号（相对光单位，RLU）
      16. 数据分析与判断：
      17. 计算诱导倍数：测试组RLU/阴性对照组RLU
      18. 若最大诱导倍数≥1.5倍，且呈浓度依赖性，判定为阳性
      19. 若最大诱导倍数<1.5倍，判定为阴性

        20. 3.3 产业应用案例：某心血管植入物企业的验证经验

        企业背景：江苏某心血管医疗器械有限公司（简称“心脉医疗”），主要产品包括药物洗脱支架、外周血管支架等。

        测试需求：2022年，该公司计划将一款新型可降解支架在中国NMPA和欧盟CE认证同步注册。传统豚鼠试验需使用60只动物，费用约4.5万美元，周期6周。考虑到产品材料（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）已有大量文献支持其生物相容性，企业决定采用KeratinoSens方法进行致敏性测试。

        ISO 13485要求对供应商进行严格评估，保障原料质量。

        验证过程：

        • 制备支架材料浸提液（按ISO 10993-12，0.2g/mL，37℃，24小时）
        • 设置6个稀释浓度（100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%）
        • 三次独立实验，每次设3个复孔
        • 阳性对照DNCB（0.5-4μg/mL）验证系统灵敏度

        结果：

        • 所有浓度下诱导倍数均<1.2倍
        • 细胞活性>80%（MTT法验证无细胞毒性）
        • 判定为阴性（无致敏性）

        监管认可：该数据被NMPA医疗器械技术审评中心和欧盟公告机构（TÜV SÜD）同时接受，节省测试成本约3.2万美元，缩短项目周期4周。企业后续将KeratinoSens方法纳入标准操作规程，用于所有新产品的早期筛选。

        3.4 方法优势与局限性

        优势：

        • 操作简便，标准化程度高
        • 与人体致敏性数据相关性良好（OECD验证报告显示灵敏度77%，特异性96%）
        • 适合高通量筛选
        • 成本较低（单次测试约500-800美元）

        局限性：

        • 仅检测Nrf2/ARE通路，可能遗漏某些非Nrf2依赖的致敏机制
        • 对某些金属离子（如镍、钴）的检测灵敏度有限
        • 不能区分致敏物与刺激物（需额外细胞毒性测试排除假阳性）

        四、SENsiPac方法：原理、流程与产业应用

        4.1 方法学原理与作用机制

        SENsiPac方法由日本Kao Corporation开发，并经OECD测试指南第442E项验证。该方法基于人单核细胞系THP-1，模拟树突状细胞在皮肤致敏过程中的成熟反应。当致敏物作用于THP-1细胞时，会诱导细胞表面标志物CD86和CD54的表达上调，这些标志物是树突状细胞抗原呈递功能的关键分子。

        与KeratinoSens不同，SENsiPac方法更接近体内免疫反应的初始步骤——抗原呈递细胞的活化，因此被认为具有更高的生物学相关性。

        4.2 标准操作流程与关键控制点

        SENsiPac方法的标准操作流程包括：

        1. 细胞培养与准备：
        2. THP-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养
        3. 细胞密度维持在2×10⁵-1×10⁶细胞/mL
        4. 实验前24小时将细胞接种于24孔板，密度为2×10⁵细胞/孔
        5. 样品制备与暴露：
        6. 测试样品按ISO 10993-12制备浸提液
        7. 浸提介质包括RPMI-1640培养基（无血清）和DMSO（最终浓度≤0.5%）
        8. 浸提条件：37℃±1℃，24小时±2小时
        9. 浸提液需调整pH至7.2-7.4
        10. 细胞暴露与标志物检测：
        11. 将浸提液按梯度稀释（通常为4-6个浓度）加入细胞培养板
        12. 暴露时间：48小时
        13. 同时设置阳性对照（DNCB，浓度梯度）和阴性对照（DMSO）
        14. 暴露结束后，收集细胞，用荧光标记的抗CD86和抗CD54抗体染色
        15. 使用流式细胞仪检测阳性细胞比例
        16. 数据分析与判断：
        17. 计算诱导倍数：测试组阳性细胞比例/阴性对照组阳性细胞比例
        18. CD86诱导倍数≥1.5倍或CD54诱导倍数≥2.0倍，判定为阳性
        19. 若两者均低于阈值，判定为阴性
        20. 需同时确认细胞活性≥70%（PI染色排除细胞毒性干扰）

          21. 4.3 产业应用案例：某骨科植入物企业的跨市场注册

          企业背景：北京某骨科医疗器械有限公司（简称“骨康科技”），主要产品包括人工髋关节、膝关节植入物。

          测试需求：2023年，骨康科技计划将其钴铬钼合金人工髋关节同时申报美国FDA 510(k)和日本PMDA注册。FDA现代化法案2.0实施后，企业希望采用体外方法替代传统豚鼠试验，以降低动物使用量并加快注册进度。

          验证过程：

          • 制备合金材料浸提液（按ISO 10993-12，0.1g/mL，37℃，24小时）
          • 设置5个稀释浓度（100%、50%、25%、12.5%、6.25%）
          • 三次独立实验，每次设2个复孔
          • 流式细胞术检测CD86和CD54表达

          结果：

          • CD86诱导倍数：1.8倍（100%浓度）
          • CD54诱导倍数：2.3倍（100%浓度）
          • 细胞活性：85%
          • 判定为阳性（具有致敏性潜力）

          按照PAS 2060要求，碳抵消措施需符合额外性和永久性原则。

          后续处理：由于SENsiPac结果为阳性，企业进行了以下风险评估：

          1. 查阅文献确认钴铬钼合金已知具有低致敏性风险（文献报道致敏率为0.5%-2%）
          2. 进行风险-受益分析：产品用于终末期关节疾病患者，临床受益显著
          3. 在标签中增加“含钴铬钼合金，可能引起过敏反应”的警示
          4. 提交FDA时，同时提供SENsiPac阳性结果和风险分析报告

            5. 监管反馈：

            • FDA审评后接受该方案，未要求补充动物试验
            • PMDA要求补充一项人皮肤斑贴试验（使用产品材料），结果阴性后批准
            • 整体注册周期8个月，较传统方案缩短3个月

            4.4 方法优势与局限性

            优势：

            • 模拟抗原呈递细胞活化，生物学相关性更高
            • 可检测金属离子等非有机致敏物
            • 双标志物检测降低假阴性风险
            • 与人体致敏性数据相关性良好（OECD验证报告显示灵敏度80%，特异性91%）

            局限性：

            • 操作复杂，需要流式细胞仪设备
            • 细胞培养周期较长（48小时暴露）
            • 对某些弱致敏物的检测灵敏度有限
            • 成本较高（单次测试约800-1200美元）

            五、两种方法的系统比较与选择策略

            5.1 技术性能对比

            对比维度KeratinoSensSENsiPac
            细胞类型角质形成细胞（HaCaT）单核细胞（THP-1）
            模拟阶段致敏初始阶段（角质形成细胞激活）抗原呈递阶段（树突状细胞成熟）
            检测终点Nrf2/ARE通路CD86/CD54表达
            检测技术荧光素酶报告基因流式细胞术
            灵敏度（OECD数据）77%80%
            特异性（OECD数据）96%91%
            准确度（OECD数据）86%85%
            检测时间48小时48小时
            设备要求酶标仪流式细胞仪
            单次测试成本500-800美元800-1200美元
            金属致敏物检测灵敏度较低灵敏度较高
            非特异性激活风险较低中等（需排除细胞毒性）

            5.2 适用场景与选择建议

            根据ISO 10993-26和产业实践经验，两种方法的选择应考虑以下因素：

            1. 材料类型：
            2. 有机聚合物、生物材料：两种方法均可，推荐KeratinoSens（成本优势）
            3. 金属合金、含金属离子材料：优先选择SENsiPac（金属检测灵敏度更高）
            4. 陶瓷材料：两种方法均可，需注意浸提液pH控制
            5. 监管要求：
            6. 单一市场注册：可根据当地监管机构偏好选择（如日本PMDA更认可SENsiPac）
            7. 多市场注册：建议同时使用两种方法，或选择被主要市场共同认可的方法
            8. 企业资源：
            9. 中小型企业：推荐KeratinoSens（设备简单、成本低、操作易标准化）
            10. 大型企业或CRO：可同时建立两种方法，形成互补验证体系
            11. 风险等级：
            12. 低风险产品（如体外诊断设备）：KeratinoSens阴性即可
            13. 高风险植入物：建议SENsiPac验证，或两种方法联合使用

              14. 5.3 联合使用策略与数据整合

              在实际产业应用中，越来越多的企业采用“两步法”策略：

              1. 第一步：KeratinoSens初筛
              2. 快速、低成本排除大多数非致敏物
              3. 阳性结果进入第二步验证
              4. 第二步：SENsiPac确认
              5. 对KeratinoSens阳性样品进行确认
              6. 提供更全面的机制证据（角质形成细胞+树突状细胞）

                7. 案例数据：某国际CRO公司（Eurofins Medical Device Testing）2023年发布的内部数据显示，在120个医疗器械材料的测试中：

                • KeratinoSens阳性率：15%（18/120）
                • SENsiPac阳性率：12.5%（15/120）
                • 两种方法一致率：91.7%（110/120）
                • 不一致案例中，KeratinoSens阳性/SENsiPac阴性占5例，经文献检索和专家评估，其中3例判断为假阳性（非致敏物），2例为假阴性（弱致敏物）

                这一数据表明，两种方法联合使用可显著提高检测准确性，减少假阳性和假阴性风险。

                六、全球监管认可与市场准入影响

                6.1 主要市场监管机构的立场对比

                监管机构对ISO 10993-26的认可具体要求与限制备注
                美国FDA认可（2023年指南草案）需提供方法验证数据；阳性结果需风险分析；高暴露产品可能要求补充动物试验现代化法案2.0后接受度提高
                欧盟公告机构认可（MDR附录A）需符合ISO 10993-26；阳性结果需提供临床或文献证据支持NB-MED/2.12.1 rev.3指南
                中国NMPA部分认可（2023年技术指导原则）仅接受阴性结果；阳性结果需补充动物试验监管过渡期，预计2025年全面接受
                日本PMDA认可（2022年通知）推荐SENsiPac方法；阳性结果需补充人皮肤斑贴试验基于日本国内验证数据
                加拿大HC认可（2023年指南）与FDA立场一致参考FDA指南

                6.2 企业应对策略与合规路径

                基于上述监管格局，企业应采取以下策略：

                1. 提前沟通：在测试前与目标市场的监管机构或公告机构进行科学咨询，确认体外方法的可接受性。
                2. 完整验证：确保测试方法符合ISO 10993-26的验证要求，包括实验室间比对、阳性/阴性对照、细胞系稳定性等。
                3. 风险分层：
                4. 低风险产品（表面接触、短期接触）：体外方法阴性即可
                5. 中等风险产品（植入物、长期接触）：体外方法阴性+文献支持
                6. 高风险产品（心血管植入物、神经植入物）：体外方法阴性+动物试验确认（必要时）
                7. 数据包整合：将体外致敏性数据与化学表征（ISO 10993-18）、毒理学风险评估（ISO 10993-17）结合，形成完整的生物学评价报告。

                  8. 七、产业趋势与未来展望

                  7.1 技术迭代方向

                  目前，ISO 10993-26仅包含KeratinoSens和SENsiPac两种方法，但产业界和学术界正在开发更先进的替代技术：

                  • 三维皮肤模型：利用重建人体表皮模型（如EpiDerm、SkinEthic）进行致敏性测试，可同时评估皮肤渗透、代谢活化和免疫反应。
                  • 多组学整合：结合转录组学、蛋白质组学数据，建立更全面的致敏性预测模型。
                  • AI技术预测：基于QSAR（定量构效关系）和机器学习算法，对医疗器械材料的致敏性进行计算机预测。

                  7.2 标准修订展望

                  ISO 10993-26的下一轮修订（预计2026-2027年）可能包括：

                  • 增加h-CLAT（人类细胞系激活试验）作为第三种方法
                  • 引入“证据权重”概念，允许多种体外方法数据的综合评估
                  • 明确阳性结果的风险管理路径
                  • 更新金属材料和纳米材料的测试指南

                  7.3 对医疗器械产业的影响

                  ISO 10993-26的实施将深刻影响医疗器械产业：

                  1. 研发效率提升：早期筛选阶段使用体外方法，可快速淘汰高风险材料，减少后期动物试验和临床试验失败风险。
                  2. 成本结构优化：体外方法可降低30%-50%的测试成本，使中小企业也能负担全面的生物相容性评价。
                  3. 全球注册协同：统一的国际标准使企业能够使用单一测试数据包满足多国注册要求，缩短上市周期。
                  4. 伦理合规增强：减少动物使用量，符合全球动物福利法规趋势，提升企业社会责任形象。

                    5. 八、结论与建议

                    ISO 10993-26的发布标志着医疗器械致敏性测试从动物实验向体外方法的范式转移进入实质性阶段。KeratinoSens和SENsiPac两种方法各有优势，企业应根据材料类型、监管要求、资源条件和风险等级进行合理选择。联合使用两种方法可提供更全面的致敏性评估数据。

                    通过全球回收标准认证，再生塑料产品的回收含量得到验证。

                    对于医疗器械企业而言，建议采取以下行动：

                    1. 建立内部能力：投资建立体外致敏性测试平台，或与经验证的CRO建立长期合作。
                    2. 关注监管动态：密切跟踪主要市场监管机构对ISO 10993-26的采纳和更新。
                    3. 参与标准讨论：通过行业协会参与ISO 10993-26的修订工作，反映产业需求。
                    4. 积累证据数据：建立企业内部数据库，积累不同材料类型的体外致敏性数据，为未来产品开发提供参考。

                      5. 随着3R原则的深化和监管体系的演进，体外替代方法将从“可选”变为“主流”，掌握这一技术转型的企业将在市场竞争中获得先发优势。

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                      参考来源：

                      1. ISO 10993-26:2021, Biological evaluation of medical devices — Part 26: In vitro sensitization testing
                      2. OECD Test Guideline No. 442D: In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase Test Method (2018)
                      3. OECD Test Guideline No. 442E: In Vitro Skin Sensitisation: Human Cell Line Activation Test (h-CLAT) (2018)
                      4. U.S. FDA, "Use of International Standard ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing within a risk management process," Draft Guidance (2023)
                      5. European Commission, Regulation (EU) 2017/745 on Medical Devices (MDR)
                      6. U.S. FDA, Modernization Act 2.0 (2022)
                      7. Grand View Research, "Medical Device Biocompatibility Testing Market Report" (2023)
                      8. Eurofins Medical Device Testing, "Comparative Analysis of In Vitro Sensitization Methods" (2023)
                      9. Japan PMDA, "Notification on Biological Evaluation of Medical Devices" (2022)
                      10. China NMPA, "Technical Guidance for Biological Evaluation of Medical Devices" (2023)

                        11. 权威参考来源

                        标签:
                        ISO 10993医疗器械FDAPAS 2060ISO 13485ISO 14067全球回收标准